Degre nan pite pwoteyin egzije depann sou itilizasyon nan fen nan pwoteyin.
Pou kèk aplikasyon, yon ekstrè bit se ase. Sepandan, pou lòt itilizasyon, tankou nan manje ak pharmaceutique, yon wo nivo de pite yo mande yo. Pou yo rive nan sa a plizyè metòd pou pirifye pwoteyin yo tipikman itilize, nan yon seri de etap pou pirifye.
Chak etap pwoteksyon pwoteyin anjeneral rezilta nan kèk degre nan pèt pwodwi. Se poutèt sa, yon ideyal estrateji pirifikasyon ideyal se youn nan ki nivo ki pi wo nan pou pirifye rive nan etap sa yo pi piti. Seleksyon an ki etap yo itilize se depann sou gwosè a, chaj, solubility ak lòt pwopriyete nan pwoteyin sib la. Teknik sa yo ki pi apwopriye pou pirifye yon sèl pwoteyin sitosolik. Pervikasyon nan konplèks pwoteyin cytosolik se pi konplike epi anjeneral mande pou metòd diferan yo aplike.
Premye etap pou pirifye Pwoteyin
Premye etap la nan pirifye entaselilè (anndan selil la) pwoteyin se preparasyon an nan yon ekstrè bit .
Ekstrè a pral gen yon melanj konplèks nan tout pwoteyin ki soti nan sitoplasm selil la, ak kèk macromolekil adisyonèl, kofaktè, ak eleman nitritif. Ka ekstrè a bit dwe itilize pou kèk aplikasyon nan biotechnologie, sepandan, si pite se yon pwoblèm, etap ki fèt pou pirifye dwe swiv.
Ekstrè pwoteyin grosye yo prepare pa retire nan debri selil ki te pwodwi pa lysis selil, ki se reyalize lè l sèvi avèk pwodwi chimik ak anzim , sonication oswa yon franse Press. Debri a se retire nan santrifigasyon, ak supernatant la refè. Yo ka jwenn preparasyon petwòl nan pwoteyin ekstrazilè pou tou senpleman retire selil yo pa santrifigasyon.
Pou sèten aplikasyon pou biotechnologie , gen yon demand pou anzim tèstable: anzim ki ka tolere tanperati ki wo san denaturasyon, ak pandan y ap kenbe yon aktivite espesifik segondè. Òganis ki pwodui yo pafwa yo rele èkstrofil. Yon apwòch fasil pou pirifye yon pwoteyin chalè ki reziste se denatire pwoteyin yo lòt nan melanj lan pa chofaj, Lè sa a, refwadi solisyon an (kidonk pèmèt anzim la tèstazabl nan refòm oswa redissolve, si sa nesesè.Denpran pwoteyin yo ka Lè sa a, dwe retire nan santrifugasyon.
Entèmedyè pirifikasyon etap
Nan tan lontan, yon komen dezyèm etap nan pirifye yon pwoteyin ki sòti nan yon ekstrè bit te pa presipitasyon nan yon solisyon ak fòs osmotik segondè (sètadi solisyon sèl). Asid nikleyè nan ekstrè a bit ka retire pa granula presipitasyon ki te fòme ak silfat streptomycin oswa silfat protaminin.
Pwoteyin presipitasyon anjeneral fè sulfat amonyòm kòm sèl la.
Diferan pwoteyin ap presipite nan diferan konsantrasyon nan silfat amonyòm . An jeneral, pwoteyin nan pi wo presipite molekilè pwa nan pi ba konsantrasyon nan sulfat amonyòm. Sèk presipitasyon pa anjeneral mennen nan yon pwoteyin trè pirifye men li ka ede nan elimine kèk pwoteyin vle nan yon melanj ak konsantre echantiyon an. Sèl nan solisyon an yo Lè sa a, retire pa dyaliz nan porous tubulèr kulotchou, filtraj, oswa chromatograf esklizyon jèl.
Pwotokòl modèn biotech souvan pran avantaj de anpil twous komèsyal ki disponib ki bay solisyon yo pare pou fè pwosedi estanda. Pwoteyin pwoteksyon souvan fèt lè l sèvi avèk filtè ak kolòn kolòn filtraj. Tout sa ou dwe fè se swiv enstriksyon yo epi ajoute volim nan dwa nan solisyon an dwa epi tann longè a espesifye nan tan pandan y ap kolekte eluant a (sa ki soti lòt la nan fen kolòn nan) nan yon tib fre.
- Metòd chromatografik ka aplike lè l sèvi avèk kolòn ban-tèt oswa otomatik ki fonksyone HPLC. Separasyon pa HPLC ka fè pa ranvèse faz, ion-echanj oswa metòd-eksklizyon metòd, ak echantiyon detekte pa etalaj diode oswa teknoloji lazè.
Pwoteyin vizyalizasyon ak evalyasyon nan pirifye
- Fèy chromatografi Reverse-faz (RPC) separe pwoteyin ki baze sou idrofotèk relatif yo. Teknik sa a se trè selektif men mande pou itilize nan Solvang òganik. Gen kèk pwoteyin ki pèrmante denatire pa Solvang epi yo pral pèdi fonctionnalités pandan RPC. Se poutèt sa, metòd sa a pa rekòmande pou tout aplikasyon, sitou si li nesesè pou pwoteyin sib la kenbe aktivite.
- Iwon echanj chromatografi refere a separasyon an nan pwoteyin ki baze sou chaj . Kolòn ka swa pou prepare pou echanj anyon oswa echanj kation. Anyon echanj kolòn gen ladan yon faz estasyonè ak yon chaj pozitif ki atire pwoteyin negatif chaje. Kolòn echanj koleksyon yo se do a, pèl negatif chaje ki atire pwoteyin pozitivman chaje. Elisyon nan pwoteyin sib la (yo) fè pa chanje pH a nan kolòn nan, ki rezilta nan yon chanjman oswa netralizasyon nan chaje fonksyonèl gwoup yo nan chak pwoteyin.
- Size-eksklizyon chromatografi ( jèl filtraj ) separe pi gwo pwoteyin nan ti piti yo depi pi gwo molekil yo vwayaje pi vit nan kiltivatè a kwa-lye nan chromatografi kolòn nan. Pwoteyin yo gwo pa anfòm nan porositë yo nan polymère a Lè nou konsidere ke pwoteyin ki pi piti fè, epi pran pi long yo vwayaje nan kolòn nan chromatografi, atravè wout mwens dirèk yo. Elimine yo kolekte nan yon seri de tib ki separe pwoteyin ki baze sou elisyon tan. Filtraj jele se yon zouti itil pou konsantre sou yon echantiyon pwoteyin depi pwoteyin sib la ranmase nan yon volim elit ki pi piti pase te okòmansman te ajoute nan kolòn lan. Filtration menm jan teknik yo ka itilize pandan gwo-echèl pwodiksyon pwoteyin paske yo te pri-efikasite.
- Affinité chromatografi se yon teknik trè itil pou "polisaj" oswa ranpli pwosesis la pou pirifye pwoteyin. Pèl nan kolòn nan kromatograf yo kwa-lye nan ligand ki mare espesyalman nan pwoteyin nan sib. Lè sa a, pwoteyin lan retire nan kolòn nan pa rense avèk yon solisyon ki gen ligand gratis. Metòd sa a bay rezilta yo pur ak pi wo espesifik aktivite konpare ak lòt teknik.
- SDS-PAGE se elèktroforèz jèl poliyakrilid, ki fèt nan prezans SDS (sodyòm dodecyl sulfat) ki mare pwoteyin ba yo yon gwo chaj negatif negatif. Depi chaj yo nan tout pwoteyin yo egalman egal, metòd sa a separe yo prèske antyèman ki baze sou gwosè. SDS-PAGE se souvan yo itilize tès pite a nan pwoteyin apre chak etap nan yon seri. Kòm pwoteyin vle yo piti piti yo retire nan melanj la, se kantite gwoup ki visualized sou jèl la sd-PAGE redwi, jiskaske gen yon sèl gwoup ki reprezante pwoteyin a vle.
- Immunoblotting se yon teknik vizyalizasyon pwoteyin ki aplike nan konbinezon ak chromatografi afinite. Antikò pou yon pwoteyin espesifik yo itilize kòm ligand sou yon kolòn chromatograf afinite. Pwoteyin sib la kenbe sou kolòn nan, Lè sa a, retire pa rense kolòn nan ak yon solisyon sèl oswa lòt ajan yo. Antikò ki asosye avèk radyoaktif oswa etikèt etikèt èd nan deteksyon an nan pwoteyin sib la yon fwa li separe de rès la nan melanj lan.
Sous:
Zubay G. 1988. Biochimie, 2nd edisyon. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manyèl pwotin pou pirifye, edisyon AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Etazini. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.