Ajisteman nan nenpòt nan eleman ki nan yon Reyaksyon reyaksyon chimik Polymerase (PCR) ka chanje bon jan kalite a nan rezilta a, swa pa amelyore oswa diminye sede pwodwi a ak bon jan kalite oswa pa amelyore espesifik nan reyaksyon ak sansiblite. Paramèt ki enfliyanse rezilta nan fen yo ka swa fizik (sa vle di, tanperati, fwa sik) oswa chimik (sètadi, konsantrasyon modèl, kalite anzim yo itilize). Sa ki anba la yo se plizyè faktè kle ki enfliyanse siksè nan PCR.
01 Kondisyon laboratwa pwòp
Depi PCR se kapab detekte yon molekil sèl ADN, li enpòtan pou kenbe kondisyon primitif nan laboratwa a. Toujou mete gan fre, sèvi ak esterilize esteril, tib ak pipè konsèy ak solisyon esteril, epi netwaye zòn travay la anvan travay kòmanse.
Toujou gen ladan reyaksyon kontwòl, san ADN modèl ak san anzim, asire rezilta yo vrèman akòz anplifikasyon nan echantiyon an dwa.
Pifò moun asire ke yo gen pwòp seri solisyon yo ki pa pataje pou fè depanaj pi fasil ak pipi deziye yo souvan mete sou kote pou PCR sèlman. DNase ak RNase-gratis tib PCR, konsèy pipip ayerosol ki reziste ak travay nan yon kapo fume ak UV limyè yo tou fason pou minimize pwoblèm.
02 Eleman Chimik
- Fè 18 a 24 baz
- Pa gen okenn estrikti segondè (sa vle di, pasan an kwiv)
- Fè balanse distribisyon G / C ak A / T pè
- Pa konplemé youn ak lòt nan 3-pye fini yo
- Fè tanperati k ap fonn (Tm) sou 5-10 degre Celcius anba tanperati a annealing, ki se nòmalman ant 55 ak 65 degre Celcius
Tm la pou toude primè yo ta dwe tou menm jan an pou pi bon rezilta yo.
03 Reyaksyon Melanje: Modèl ak Primè
Konsantrasyon primè optimal yo ant 0.1 ak 0.6 mikromol / L. Kantite modèl la varye selon kalite ADN (imen, bakteri, plasmid).
Avèk kantite lajan ki ba anpil nan modèl, gen lòt estrateji pou amelyore rezilta, tankou nimewo sik ogmante oswa itilize "kòmanse cho". Toujou teste nouvo priyorite ak yon reyaksyon kontwòl pozitif, pou asire ke yo travay anba kondisyon espesifik eksperimantal ou yo.
04 Reyaksyon Melanje: Aktivite Enzym
Konsantrasyon MgCl2 nan melanj reyaksyon an ka enfliyanse rezilta PCR la e li ka jwe yon wòl enpòtan nan reyaksyon pi rapid. Manyezyòm kation fòme konplèks soluble ak dNTPs yo pwodwi substra aktyèl la ki anzim nan polymerase rekonèt.
Kantite egal nan tout kat dNTP yo ede tou diminye pousantaj erè polymerium. Sèten aditif tankou betaine, BSA, detèjan, DMSO, gliserin, ak pirosfatataz ka afekte tou espesifik anzim oswa efikasite reyaksyon.
05 Kalite Thermocycler
Lè fè makèt pou ekipman laboratwa, met nan tèt ou ke kèk thermocyclers yo mwens presi pase lòt moun nan kenbe egzak, tanperati vle.
Sa a se yon zòn ki kote bon mache pa pral peye nan kouri nan longè lè ou ap fè fas ak yon reyaksyon pwentiyeu oswa lè l sèvi avèk prime ki mande pou yon seri etwat nan tanperati tanpèt.
Tib reyon mi-ranje ki fèt pou anfòm mak egzak thermocycler ou ap itilize, ede tou optimize tanperati reyaksyon yo.
06 Sik Anviwònman
Ka Ogmante sede ka reyalize lè yo ogmante tan an ekstansyon sou chak 20 sik, pou konpanse pou mwens anzim ogmante plis modèl. Anjeneral, mwens pase 40 sik se ase pou enplike mwens pase 10 molekil modèl nan yon konsantrasyon gwo ase yo wè sou yon etidium bromide-tache agaroz jèl .