Sekans ADN tou depann de kapasite nou pou itilize elektwoforèz jèl pou separe ADN ki diferan nan gwosè pa tankou yon sèl pè.
Sequencing ADN
Nan ane 1970 yo an reta, de ADN sekans teknik pou molekil pi long ADN te envante. Sa yo se Sanger (oswa dideoxy) metòd la ak metòd la Maxam-Gilbert (chipaj chimik). Metòd Maxam-Gilbert la baze sou klinik nukleotid espesifik pa pwodwi chimik yo epi li pi byen itilize sekans oligonukleotid (polymère kout nukleotid, anjeneral ki pi piti pase 50 baz-pè nan longè). Metòd la Sanger se pi souvan itilize paske li te pwouve teknikman pi fasil pou aplike, epi, ak avènement de PCR ak automatisation nan teknik la, se fasil aplike nan strings long nan ADN ki gen ladan kèk jèn tout. Teknik sa a baze sou revokasyon chèn pa dideoxynucleotides pandan reyaksyon elè PCR yo.
Sanger Metòd
Nan metòd Sanger, yo itilize strand ADN pou itilize kòm yon modèl ak ADN polymerase ki itilize, nan yon reyaksyon PCR, pou jenere strings flater lè l sèvi avèk primè yo.
Kat diferan reyaksyon reyaksyon PCR yo prepare, chak ki gen yon sèten pousantaj nan analogue dideoxynucleoside triphosfat (ddNTP) nan youn nan kat nucleotides yo (ATP, CTP, GTP oswa TTP). Sentèz nan strè ADN nan nouvo ap kontinye jiskaske youn nan sa yo analòg yo enkòpore, nan ki tan se Strandye a prematireman twonke.
Chak reyaksyon PCR pral fini ki gen yon melanj de longè diferan nan ADN strings, tout fini ak nukleotid la ki te dideoxy ki make pou reyaksyon sa a. Jèl elektwoforèz la Lè sa a, itilize yo separe seksyon yo nan kat reyaksyon yo, nan kat liy separasyon, epi detèmine sekans nan modèl orijinal la ki baze sou ki longè nan seksyon fini ak sa ki nucleotide.
Nan reyaksyon an Sanger otomatik, prime yo itilize ki make ak kat diferan koulè fluorescent ki gen koulè pal. Reyaksyon PCR, nan prezans nikleotid diferan dideoxy, yo fèt jan sa dekri anwo a. Sepandan, pwochen, melanj yo reyaksyon kat yo konbine ak aplike nan yon liy sèl nan yon jèl. Yo detekte koulè chak fragman lè l sèvi avèk yon gwo bout bwa lazè epi enfòmasyon yo ranmase pa yon òdinatè ki jenere chromatogram ki montre tèt pou chak koulè, ki soti nan ki ka sekans ADN nan modèl yo ka detèmine.
Tipikman, metòd la sekrè otomatik se sèlman egzat pou sekans jiska yon maksimòm de 700-800 baz-pè nan longè. Sepandan, li posib jwenn sekans konplè nan pi gwo jèn ak, an reyalite, jnom antye, lè l sèvi avèk metòd etap-ki gen bon konprann tankou Mache Primer ak gè Sequencing.
Nan Mache Primer , yon pòsyon travayabl nan yon jèn ki pi gwo se sekans lè l sèvi avèk metòd la Sanger. New primeur yo te pwodwi nan yon segman serye nan sekans lan ak itilize yo kontinye sekansi pòsyon nan jèn ki te soti nan ranje reyaksyon orijinal yo.
Sezon fonksyone gen ladan owaza koupe segman ADN nan enterè nan plis apwopriye (jere) fragman gwosè, sekans chak fragman, ak fè aranjman moso yo ki baze sou sekans sipèpoze. Teknik sa a te vin pi fasil pa aplikasyon an nan lojisyèl òdinatè pou fè aranjman moso yo sipèpoze.