Ki sa ki PCR gen fè ak Sequencing ADN ak Jèn Amplification
Reyaksyon nan chèn polymerium ( PCR ) se yon teknik jenetik molekilè pou fè kopi miltip nan yon jèn epi tou se yon pati nan pwosesis la sekans jen.
Kouman reyaksyon chimik polymererase?
Gene copies yo te fè lè l sèvi avèk yon echantiyon ADN, ak teknoloji a bon ase pou fè kopi miltip soti nan yon sèl kopi jèn ki nan egzanp lan. PCR anplifikasyon yon jèn fè dè milyon de kopi, pèmèt pou deteksyon ak idantifikasyon nan sekans jèn lè l sèvi avèk teknik vizyèl ki baze sou gwosè ak chaj (+ oswa -) nan moso ADN.
Anba kondisyon kontwole, segman ti ADN yo pwodwi pa anzim li te ye kòm polymatik ADN, ki ajoute deoksynukleotid flater (dNTPs) nan yon moso ADN ke yo rekonèt kòm "modèl la." Menm pi piti moso nan ADN, ki rele "primè" yo te itilize kòm yon pwen depa pou polymerase la. Primè yo se ti moso fè nan ADN (oligomèr), anjeneral ant 15 ak 30 nucleotides long. Yo te fè nan konnen oswa devine sekans ADN kout nan bout yo anpil nan jèn nan yo te anplifye. Pandan PCR, ADN ap sekwe chofe ak seksyon doub yo separe. Lè yo fin refwadi, priyorite yo mare modèl la (rele annealing) epi kreye yon kote pou polymerase a kòmanse.
Teknik PCR a
Reyaksyon nan chèn polymerium (PCR) te fè posib pa dekouvèt la nan tèrmofil ak tèrmofil polymerzyma anzim (anzim ki kenbe estriktirèl entegrite ak fonctionnalités apre chofaj nan tanperati ki wo).
Etap ki enplike nan teknik PCR la se jan sa a:
- Yon melanj ki kreye, ak optimize konsantrasyon nan modèl ADN, anzim polymerase, primè, ak dNTPs. Kapasite nan chofe melanj lan san yo pa denatire anzim la pèmèt pou denaturasyon nan helix a doub nan echantiyon ADN nan tanperati nan seri a nan 94 degre Sèlsiyis.
- Apre denaturation, se echantiyon an refwadi nan yon seri plis modere, alantou 54 degre, ki fasilite konsekans lan (obligatwa) nan primè yo nan modèl yo ADN sèl-bloke.
- Nan twazyèm etap sik la, se echantiyon an chofe a 72 degre, tanperati ideyal la pou Taq DNA Polymerase, pou elongasyon. Pandan elongasyon, ADN polymerase itilize orijinal sèl strang ADN kòm yon modèl pou ajoute dNTPs konplemantè nan 3 'fini nan chak Jadendanfan ak jenere yon seksyon ADN doub-bloke nan rejyon an nan jèn nan enterè.
- Primè yo ki te annealed sekans ADN ki pa yon matche egzak pa rete anne nan 72 degre, konsa limite elongasyon jèn nan enterè yo.
Pwosesis sa a nan denaturation, rantre ak elongasyon yo repete miltip (30-40) fwa, kidonk ogmante eksponansyèlman kantite kopi jèn yo vle nan melanj la. Malgre ke pwosesis sa a ta dwe byen fatigan si fèt manyèlman, echantiyon yo ka prepare ak enkubatèd nan yon Thermocycler pwogramasyon, kounye a Choudrant nan pifò molekilè laboratwa, epi yo ka yon reyaksyon PCR konplè dwe fèt nan èdtan 3-4.
Chak etap denaturation sispann pwosesis la elongasyon nan sik la anvan, kidonk truncating strand nan nouvo nan ADN ak kenbe li nan apeprè gwosè a nan jèn la vle.
Ka dire a nan sik la elongation dwe fè pi long oswa pi kout depann sou gwosè a nan jèn nan enterè, men evantyèlman, nan repete sik nan PCR, majorite nan modèl yo pral restriksyon nan gwosè a nan jèn nan enterè pou kont li, menm jan yo yo pral pwodwi nan pwodwi nan tou de nan prime yo.
Gen plizyè faktè diferan pou PCR siksè ki ka manipile pou amelyore rezilta yo. Metòd ki pi lajman itilize pou tès pou prezans nan pwodwi PCR se elèktroforèz agaroz jèl . Ki itilize pou separe fragman ADN ki baze sou gwosè ak chaj. Fragman yo Lè sa a, visualized lè l sèvi avèk koloran oswa radyoisotòp.
Evolisyon an
Depi dekouvèt la nan PCR, polymère ADN lòt pase Taq orijinal la yo te dekouvri. Gen kèk nan sa yo gen pi bon "koripsyon" kapasite oswa yo gen plis ki estab nan pi wo tanperati, enben, amelyore espesifik nan PCR ak diminye erè soti nan ensèsyon an nan dNTP a kòrèk.
Gen kèk varyasyon nan PCR yo te fèt pou aplikasyon pou espesifik ak yo kounye a yo itilize regilyèman nan laboratwa jenetik molekilè. Gen kèk nan sa yo se Reyèl tan PCR ak Reverse-Transcriptase PCR. Dekrè PCR la te mennen tou nan devlopman sekans ADN , anprent dijital ADN ak lòt teknik molekilè.